Algunos géneros
bacterianos, entre los que destacan Clostridium yBacillus,
producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de
los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.)
formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de
esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior.
Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma
vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las
bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su
estudio y observación son de enorme interés.
FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a
los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las
esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de
difícil tinción.
La tinción específica de esporas requiere dos
colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en
caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las
formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán
el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que
quedarán teñidas con el segundo colorante.
REALIZACIÓN
Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las
bacterias produzcan las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y
para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente
las instrucciones.
1. Preparar los frotis bacterianos indicados.
2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera
colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante
humee durante 5 min.
Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si
éste se evapora; es importante que la muestra no se seque.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Teñir con safranina 1 min.
5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la preparación al microscopio.
Safranina
Útil para el estudio de cultivos y productos biológicos líquidos. Los
elementos fúngicos se tiñen de color rojo intenso, y el resto del campo
toma un tono incoloro oro sapálido.
Azul de algodón
El azul de lacto fenol tiene tres funciones importantes a la
hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos por aislamiento de medios
inoculados. El fenol destruye la flora acompañante. El ácido láctico
conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente
osmótico con relación al interior del fúngico generando una película por
así llamarlo protectora.
Es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya que
es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente
las estructuras fúngicas. El colorante es fuertemente ácido y se usa
para la tinción directa de micelio micólico, el cual toma un delicado
color azul claro.
Composición:
• Alcohol metílico
• Azul de algodón acetico
• Agua destilada 250 mL
• Alcohol al 96%
• Xilol
Anaranjado de Acridina
Se utiliza para la detección de bacterias y hongos en muestras
clínicas Puede utilizarse un microscopio con
accesorios fluorescentes como el de Reichert Zetopan.
El microscopio ordinario puede equiparse con filtros para
filtración fluorescente (BG12, de 4 mm de espesor). Se colocan filtros
amarillos de modo de barreras filtrantes.
Fundamento: El pigmento se intercala en el ácido nucleico (nativo
y desnaturalizado). Con pH neutro, las bacterias, los hongos y el material
celular se tiñen de naranja rojizo. Con pH ácido, las bacterias y los
hongos se mantienen de color naranja rojizo, pero el material de fondo se
tiñe de amarillo verdoso.
Composición:
× Alcohol
absoluto
× Ácido
acético
× Anaranjado
de acridina
× Buffer de fosfatos
× Cloruro de calcio.
Tinción con Eritrosina
Útil para la observación de gránulos causados por:
• Nocardia
• Madurellagrisea
• M. mycetomatis
Solución de eritrosina.
Reactivos utilizados:
• Eritrocinade Grübler0.20g
• Naranja G 1g
• Agua destilada 100mL
Tinciones diferenciales: Son técnicas que utilizan dos o
más colorantes y/o principios activos.
Tinción de Gram
Tinción diferencial: Se emplea para teñir: Productos biológicos
líquidos Exudados de lesiones Macerados de
biopsias. Todos los hongos son positivos a la coloración de Gram, excepto
Cryptococcusneoformans.
l.-de colorante alcohol acetona disuelve a los lípidos de
la pared impidiendo la retención del cristal violeta en
los organismos Gram negativos. Se forma un complejo:
lugol-cristal-violeta-ribonucleato de magnesio Esta técnica se
basa en las diferencias en el punto isoeléctrico
Tinción Ziehl – Neelsen (Ácido-Alcohol-Resistentes)
Es el procedimiento utilizado para colorear aquellos organismos que
son difíciles de colorear con colorantes básicos, porque se muestran
impermeables a la coloración. El contenido lipídico de estos
organismos está compuesto principalmente por ceras y fosfolípidos
que alcanzan hasta un 40% de su peso seco total.
La ácido-alcohol-resistencia es la capacidad de ciertos materiales
biológicos para formar complejos con algunos colorantes y que luego de la
exposición al alcohol-ácido no ocurre de coloración Se cree que el
ácido micólico es responsable de ácido- alcohol-resistencia. Útil en
algunos microorganismos ácido resistentes como N.Asteroides,
N.Brasiliensis y otros actinomicetes.
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