TINCION DE GRAM (PASOS)

• Cómo hacer una tinción de Gram

La tinción de Gram es un procedimiento rápido que se usa para buscar la presencia de bacterias en muestras de tejidos y caracterizarlas como Gram positivas o Gram negativas en base a las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares. La tinción de Gram casi siempre debe realizarse como el primer paso en el diagnóstico de una infección bacteriana.

La tinción de Gram se llama así por el científico danés Hans Christian Gram (1853 – 1938), quien desarrolló la técnica en 1882 y la publicó en 1884 como una técnica para distinguir entre dos tipos de bacterias con síntomas clínicos similares: las bacterias Streptococcus pneumoniae (también conocida como neumococo) y Klebsiella pneumoniae.

1.- Prepárate para el trabajo de laboratorio. Colócate guantes y amárrate el cabello si lo tienes largo para evitar contaminar la muestra de bacteria que vayas a analizar. Desinfecta un espacio de trabajo debajo de la campana extractora o en otra área bien ventilada. Antes de comenzar, revisa que el mechero Bunsen y el microscopio estén operativos.

2.-Esteriliza un portaobjetos de vidrio para microscopio. Si el portaobjetos está sucio, lávalo con agua jabonosa para eliminar la grasa y la suciedad. Desinféctalo con etanol, limpiador de vidrios o el método que recomiende tu laboratorio

3.- Coloca la muestra en el portaobjetos. Puedes usar el método de la tinción de Gram para ayudar a identificar las bacterias presentes en muestras médicas o en cultivos de bacterias en una placa de Petri. Para que la tinción de Gram sea útil, coloca una capa delgada de la muestra sobre el portaobjetos. Es recomendable una muestra que tenga menos de 24 horas, ya que las bacterias más antiguas pueden tener paredes celulares dañadas que responderán de forma menos predecible a la tinción de Gram.

• ·         Si vas a usar una muestra de tejido, coloca de 1 a 2 gotas de la muestra en el portaobjetos de vidrio. Extiéndela uniformemente sobre el portaobjetos para formar una mancha delgada usando el borde de un segundo portaobjetos de vidrio esterilizado. Deja que se seque con el aire antes de continuar.
• ·         Si vas a tomar bacterias de una placa de Petri, esteriliza un asa bacteriológica en la llama de un mechero Bunsen hasta que brille, luego deja que se enfríe. Úsala para colocar una gota de agua esterilizada sobre el portaobjetos y luego esteriliza y enfría el asa otra vez antes de transferir una pequeña muestra de bacteria al portaobjetos y revolverla suavemente en el agua.
• ·         Las bacterias en un medio de cultivo deben mezclarse en un agitador de vórtice y luego colocarse en el portaobjetos con un asa bacteriológica, como se indica anteriormente, pero sin agregar el agua adicional.

·         Si tienes una muestra en un hisopo, pásalo ligeramente por encima del portaobjetos.

 4.- Fija la muestra por calor. El calor fijará las bacterias al portaobjetos de forma que no se enjuaguen tan fácilmente durante la tinción. Pasa rápidamente el portaobjetos dos o tres veces por la llama de un mechero Bunsen o caliéntalo sobre un calentador de portaobjetos eléctrico. No lo sobrecalientes o las muestras podrían distorsionarse. Si vas a usar un mechero Bunsen, la llama debe ser un cono pequeño y azul, no uno alto y anaranjado.

Alternativamente, la muestra puede fijarse con metanol, agregando 1 o 2 gotas sobre la mancha seca, drenando el exceso de metanol y dejando que se seque con el aire. Este método minimiza el daño a las células huésped, dándoles un fondo más limpio.

5.- Posiciona el portaobjetos en una bandeja para tinción. Una bandeja para tinción es una bandeja poco profunda de metal, vidrio o plástico con una pequeña malla o soporte de alambre a lo largo de la parte superior. Coloca el portaobjetos sobre este soporte de forma que los líquidos que vayas a usar puedan drenarse sobre la bandeja.

• ·   Si no tienes una bandeja para tinción, el portaobjetos puede colocarse directamente sobre una cubeta de plástico para hielo.
• 6.-Empapa la muestra con cristal violeta. Usa una pipeta para empapar la muestra de la bacteria con varias gotas de tinte cristal violeta, a veces llamado violeta de genciana. Espera de 30 a 60 segundos. En una solución acuosa, el cristal violeta (CV) se disocia en CV+ e iones de cloruro (Cl-). Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de células tanto Gram positivas como Gram negativas. El ion CV+ interactúa con los componentes con carga negativa de las células bacterianas para mancharlas de violeta.
  ·         Muchos laboratorios usan el cristal violeta de "Hucker", el cual agrega oxalato de amonio para evitar la precipitación.
• 7.- Enjuaga suavemente el cristal violeta. Inclina el portaobjetos y usa un matraz de lavado para rociar un pequeño chorro de agua destilada o de grifo sobre la parte superior del portaobjetos. El agua debería escurrirse sobre la superficie de la mancha pero no estar apuntada directamente a ella.
   No enjuagues excesivamente, lo cual puede quitar la tinción de las bacterias Gram positivas.

Empapa la mancha con yodo y luego enjuaga. Usa una pipeta para cubrir la mancha con yodo. Déjala reposar por lo menos por 60 segundos, luego enjuágala cuidadosamente con el mismo método.^[11] El yodo, en la forma de iones con carga negativa, interactúa con los iones CV+ para formar grandes compuestos de cristal violeta y yodo (compuestos CV-I) dentro de las capas interiores y exteriores de la célula. Esto atrapa el color del cristal violeta en la célula, en el lugar en el que la haya teñido.

Agrega un decolorante y luego enjuaga rápidamente. Para este paso crítico, se usa normalmente una mezcla de acetona y etanol en una proporción de 1:1. La realización de este paso debe calcularse cuidadosamente. Sujeta el portaobjetos en ángulo, luego agrega el decolorante hasta que nada del color violeta sea visible en la escorrentía. Esto normalmente toma menos de 10 segundos o incluso menos tiempo si el decolorante contiene una alta concentración de acetona. 

Detente inmediatamente o el decolorante retirará la tinción de cristal violeta de células tanto Gram positivas como Gram negativas y la tinción tendrá que repetirse. Enjuaga inmediatamente el exceso de decolorante usando la técnica mencionada anteriormente.

·     Puede usarse acetona pura (95%+) en su lugar. Mientras más acetona haya, el decolorante trabajará más rápido, lo que requerirá un cálculo más preciso del tiempo.

·     Si estás teniendo problemas para calcular la realización de este paso, considera agregar el decolorante gota a gota.

Empapa la mancha con un colorante secundario y luego enjuaga. Se usa un colorante secundario, normalmente safranina o fucsina, para agregar un contraste adicional entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, tiñendo las bacterias decoloradas (Gram negativas) de rosado o rojo.^[14][15] Deja el colora